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T7體外快速轉(zhuǎn)錄試劑盒的使用事項(xiàng)涉及多個(gè)方面

更新時(shí)間:2025-07-23點(diǎn)擊次數(shù):17
  T7體外快速轉(zhuǎn)錄試劑盒是一種基于T7 RNA聚合酶的高效RNA體外合成工具,通過優(yōu)化轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件,實(shí)現(xiàn)快速、高產(chǎn)量、高特異性的RNA合成,廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)調(diào)控、RNA結(jié)構(gòu)研究、RNA疫苗開發(fā)及核酸藥物篩選等領(lǐng)域。該試劑盒利用T7 RNA聚合酶對(duì)T7啟動(dòng)子(TAATACGACTCACTATAGGG)的高度特異性識(shí)別,以含有該啟動(dòng)子的線性化質(zhì)粒DNA、PCR產(chǎn)物或合成DNA片段為模板,在四種核苷三磷酸(NTP)底物存在下,從啟動(dòng)子下游開始合成與模板DNA一條鏈互補(bǔ)的RNA。
  T7體外快速轉(zhuǎn)錄試劑盒的使用事項(xiàng)涉及模板準(zhǔn)備、反應(yīng)體系配置、操作注意事項(xiàng)及后續(xù)處理等關(guān)鍵環(huán)節(jié),以下是具體說明:
  一、模板準(zhǔn)備
  模板類型與要求
  必須使用線性化DNA模板(如質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割或PCR產(chǎn)物),且模板上游需包含T7啟動(dòng)子序列(如TAATACGACTCACTATAGGG)。
  模板下游建議避免3’突出末端,可通過T4 DNA聚合酶修平。
  模板需純凈無RNase污染,建議通過膠回收純化。
  模板濃度
  推薦用量為50 ng~1μg DNA(根據(jù)試劑盒說明書調(diào)整),過量可能導(dǎo)致非特異性轉(zhuǎn)錄。
  二、反應(yīng)體系配置
  預(yù)配液與加樣
  使用試劑盒提供的2×T7轉(zhuǎn)錄預(yù)配液,需完q溶解結(jié)晶后搖勻使用。
  典型20μL體系:模板DNA+10μL預(yù)配液+1μL T7酶+RNase-free水補(bǔ)足體積。
  溫度與時(shí)間控制
  反應(yīng)條件:37℃孵育1-2小時(shí),延長(zhǎng)時(shí)間不會(huì)提高產(chǎn)量。
  終止反應(yīng):70℃加熱10分鐘滅活T7酶。
  三、操作注意事項(xiàng)
  防止RNA降解
  全程使用RNase-free耗材(離心管、槍頭等),避免手套污染。
  可添加RNase抑制劑(如試劑盒未含)。
  避免DNA污染
  若需去除模板DNA,可加入RNase-free DNase I(37℃消化15-30分鐘),隨后用酚/氯仿抽提并乙醇沉淀純化RNA。
  特殊需求處理
  加帽RNA:需自備加帽核苷酸類似物(如NEB產(chǎn)品)。
  長(zhǎng)片段RNA:選擇優(yōu)化型試劑盒(如T7 High Efficiency Kit),支持>6000 nt的轉(zhuǎn)錄。
  四、產(chǎn)物檢測(cè)與保存
  檢測(cè)方法
  取1-3μL產(chǎn)物進(jìn)行電泳驗(yàn)證長(zhǎng)度和濃度,預(yù)期產(chǎn)量為1μg DNA生成5-10μg RNA。
  分光光度計(jì)檢測(cè)A260/A280比值(理想值≥1.8)。
  保存條件
  RNA可長(zhǎng)期儲(chǔ)存于-80℃,短期可放-20℃。
  五、常見問題與解決
  無RNA產(chǎn)物
  檢查模板是否線性化、啟動(dòng)子方向是否正確,或模板是否被RNase污染。
  RNA產(chǎn)量低
  優(yōu)化模板質(zhì)量(如膠回收純化),避免模板過量或不足。
  RNA長(zhǎng)度異常
  短于預(yù)期:檢查模板是否含T7終止序列,可改用SP6啟動(dòng)子。
  長(zhǎng)于預(yù)期:可能因模板加尾功能或線性化不徹d。

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