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如何區(qū)分各種PCR技術(shù)

 更新時(shí)間:2024-01-19 點(diǎn)擊量:651
  如何區(qū)分各種PCR技術(shù)?
  PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction)的簡稱,是一種體外擴(kuò)增特定DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù),PCR技術(shù)有很多,那么我們該如何區(qū)分各種PCR技術(shù)呢?讓我們一起來看看吧!
  一、普通PCR
  普通PCR即一代PCR,使用普通PCR擴(kuò)增儀擴(kuò)增靶基因,并通過瓊脂糖凝膠電泳對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行定性分析。
  二、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qPCR)
  實(shí)時(shí)熒光定量PCR,也叫Real-Time PCR,即二代PCR,是指在PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中加入熒光染料或者熒光基團(tuán),在整個(gè)PCR過程中通過收集熒光信號(hào)實(shí)時(shí)監(jiān)測每一個(gè)循環(huán)中擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化,最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線和CT值對(duì)待測樣品進(jìn)行定量分析。qPCR常用的有兩種方法:SYBR Green法和TaqMan探針法。
  三、數(shù)字PCR
  數(shù)字PCR即三代PCR,是對(duì)原始PCR的另一種改進(jìn),是一種能夠?qū)崿F(xiàn)核酸絕對(duì)定量的精準(zhǔn)檢測技術(shù),基于泊松分布原理將核酸樣品分配到大量獨(dú)立、平行的微反應(yīng)單元(納升級(jí))中,使每個(gè)反應(yīng)室中平均只有一個(gè)拷貝或者沒有目標(biāo)DNA分子,然后加入熒光信號(hào)進(jìn)行擴(kuò)增,從而實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)核酸分子的絕對(duì)計(jì)數(shù),提高檢測靈敏度和準(zhǔn)確度。
  四、逆轉(zhuǎn)錄PCR(Reverse T ranscription-PCR,RT-PCR)
  逆轉(zhuǎn)錄PCR也叫反轉(zhuǎn)錄PCR,將RNA的反轉(zhuǎn)錄(RT)和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增相結(jié)合,是PCR的一種廣泛應(yīng)用的變形。在RT-PCR中首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶將一條單鏈RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,再以cDNA為模板,擴(kuò)增合成目的片段。作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物。無論使用何種RNA,關(guān)鍵是確保RNA中無RNA酶和基因組DNA的污染。RT-PCR技術(shù)靈敏且應(yīng)用廣泛,可用于檢測細(xì)胞中基因表達(dá)水平,細(xì)胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。一般通過一步法或兩步法進(jìn)行,一步法是RT反應(yīng)和PCR反應(yīng)在同一試管中進(jìn)行;而在兩步法中兩個(gè)反應(yīng)是分開依次進(jìn)行的。
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