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核酸電泳實驗問題有哪些?如何解決?

 更新時間:2023-09-27 點擊量:1464

你知道核酸電泳實驗問題有哪些嗎?該如何解決呢?讓我們一起來看看吧!

一、無條帶或幾乎看不到條帶

原因:

1.上樣染料掩蓋目標條帶;

2.凝膠超限運行;

3.電極反接;

4.染色敏感度低;

5.光源錯誤。

解決方法:

1.檢查電泳中使用的加載染料的表觀遷移大小。因為染料可能會掩蓋和隱藏目標條帶,特別是在樣品量低的情況下。

2.監(jiān)測加載染料的運行時間和遷移,以避免將較小的樣品分子從凝膠上運走。

3.確保將電極正確連接至電源。設(shè)置水平凝膠時,凝膠孔應與負極位于同一側(cè)。

4.檢查制造商提供的用于檢測核酸的熒光染色劑的靈敏度。

增加染色劑用量和/或延長染色時間,使單鏈核酸顯色?;蛘撸紤]對單鏈分子 具有 更高親和力的du特染色,以提高檢測的特異性和靈敏度。

對于較厚或高百分比凝膠,應延長染色時間,以確保熒光染色劑充分滲透。

5.如果使用熒光染料進行染色,請檢查其激發(fā)波長以確保使用的光源對刺激染料進行可視化來說是最佳的。

二、條帶拖尾或擴散(模糊)

原因:

1.上樣孔形成不佳;

2.樣品超載;

3.樣品溶于高鹽緩沖液;

4.樣品含有大量蛋白質(zhì)。

解決方法:

1.灌注凝膠前,應適當清潔凝膠梳。

不可將凝膠槽填充過滿,否則會導致上樣孔連接。

移除凝膠梳之前,應預留足夠的上樣孔形成時間。

2. 在凝膠電泳中,不可使用過量樣品;每1毫米的凝膠孔寬度通常推薦0.1–0.2 μg的樣品用量。而拖尾、彎曲或U形條帶以及融合條帶均是過載凝膠的常見表現(xiàn)。

3. 檢查加載緩沖液的鹽濃度是否與選定的凝膠兼容。如有需要,可稀釋上樣緩沖液。

4. 存在于樣品中的蛋白質(zhì)可能會干擾凝膠中的樣品遷移率。通過純化樣品來去除蛋白質(zhì),或者通過在裝有SDS的加載染料中制備樣品并在加載之前加熱來分離/變性蛋白質(zhì)。

三、條帶分離不佳

原因:

1. 未選擇最佳的凝膠類型

2. 凝膠類型錯誤

3. 電壓過低或過高

4. 電泳時間過短或過長

解決方法:

1. 選擇更適合分離樣品的凝膠類型。推薦使用聚丙烯酰胺凝膠來解析核苷酸<1,000 bp。

2. 對于單鏈核酸(例如RNA)的電泳,制備用于有效分離的變性凝膠。對于雙鏈DNA的電泳,應避免使用變性凝膠,以保護雙鏈結(jié)構(gòu)。

3. 施加電壓為建議的核酸的大小范圍和使用的運行緩沖液。電壓過低或過高,都無法實現(xiàn)最佳的核酸分離。

4. 足夠長的運行凝膠以確保充分分離條帶。但電泳時間不宜過長,否則會導致過度加熱、樣品變性和條帶擴散。

更多有關(guān)核酸電泳實驗問題及解決方法,請聯(lián)系北京百奧創(chuàng)新科技有限公司:



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