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mRNA加帽工具:cellscript加帽試劑盒

 更新時(shí)間:2022-11-24 點(diǎn)擊量:1138

1970年,科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了mRNA的5’端結(jié)構(gòu)——帽子結(jié)構(gòu)(m7GpppN),它一方面保護(hù)mRNA使其具有穩(wěn)定性,另外一方面,5′端帽子還是前體mRNA剪接、多聚腺苷酸化及和核輸出的標(biāo)識(shí)符。同時(shí),mRNA的5′端帽子結(jié)構(gòu)如果出現(xiàn)異常,將會(huì)引起細(xì)胞發(fā)生抗病毒反應(yīng)。因此,RNA加帽和mRNA的擴(kuò)增,促進(jìn)了mRNA的大規(guī)模生產(chǎn),mRNA疫苗成為可能。

一、mRNA加帽原理

真核生物mRNA加帽需要在TPase、GTase、N7 MTase等酶的參與下合成帽子結(jié)構(gòu),原理如下:

(1)RNA三磷酸酶(TPase)從5’-三磷酸中去除 γ-磷酸,生成 5’-二磷酸 RNA

pppN1(p)N.-OH(3')→ ppNi(pN)x-OH(3')+Pi

(2)RNA 鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶(GTase)通過賴氨酸-GMP 共價(jià)中間體將 GMP 基團(tuán)從 GTP 轉(zhuǎn)移到 5’-二磷酸

ppN1(pN)x-OH(3')+GTP→G(5')ppp(5')N1(pN)x-OH(3')+PPi

(3)嘌呤-N7 甲基轉(zhuǎn)移酶(鳥嘌LING-N7 MTase)在鳥嘌LING帽的N7胺上添加一個(gè)甲基,形成基本帽結(jié)構(gòu)(Cap0)

G(5')ppp(5')N1(pN)x-OH(3')+AdoMet → m7G(5')ppp(5')N1(pN)x-OH(3')+ AdoHyc

(4)m7G 特異性 2’O-甲基轉(zhuǎn)移酶(mRNA Cap 2′-O-Methyltransferase)還可將核糖2’O位置的核糖核苷酸甲基化生成Cap1結(jié)構(gòu)

m7GpppN1(pN)x-OH(3')+AdoMet → m7Gppp[m3'-o]N1(pN)x-OH(3')+ AdoHyc

                                        Cap 0 RNA                                               Cap 1 RNA

二、RNA加帽酶的應(yīng)用

1. 促進(jìn)靶蛋白的表達(dá)

mRNA是蛋白質(zhì)合成的模板,因此,將mRNA導(dǎo)入細(xì)胞,促進(jìn)胞內(nèi)蛋白的表達(dá)。

2. 促進(jìn)Cap0/Cap1的RNA合成

根據(jù)上述mRNA的加帽原理,合成Cap0/Cap1結(jié)構(gòu)的mRNA。

3. 合成mRNA疫苗

只要獲取致病因子的序列,在RNA加帽酶和RNA自擴(kuò)增技術(shù)下,合成mRNA疫苗。對(duì)比于減毒疫苗,mRNA疫苗不會(huì)對(duì)載體產(chǎn)生免疫反應(yīng);對(duì)比于DNA疫苗,mRNA疫苗無需轉(zhuǎn)錄直接翻譯成蛋白質(zhì),反應(yīng)時(shí)間更快、作用更有效。

三、加帽方法

1. 酶法加帽

利用上述的加帽原理,即可獲得Cap0/Cap1結(jié)構(gòu)。北京百奧創(chuàng)新科技有限公司提供的CellScript加帽試劑盒(貨號(hào):C-SCCS1710)的反應(yīng)時(shí)間短,加帽效率高(接近100%),同類產(chǎn)品可直接交叉使用。

微信圖片_20221122133100.png

2. 共轉(zhuǎn)錄法加帽

轉(zhuǎn)錄起始,加入帽類似物,轉(zhuǎn)錄本沿著帽類似物延長(zhǎng),轉(zhuǎn)錄完成形成的mRNA就具有帽子結(jié)構(gòu)。





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